Shivam SHARMA- Faculté des Sciences

Titre de la thèse: "Roles of RYK and Mindbomb1 in Gpr124/Reck-dependent Wnt/β-catenin signaling"
Résumé:
La signalisation Wnt est une voie conservée qui a évolué chez les organismes multicellulaires. Une voie classique de transduction du signal Wnt est la voie dépendante de la β-caténine, dans laquelle la liaison des ligands Wnt à des complexes récepteurs entraîne la stabilisation cytoplasmique et l’accumulation nucléaire de la β-caténine, suivies de l’activation transcriptionnelle des gènes cibles de Wnt. Chez l’humain, 19 gènes Wnt codent des ligands sécrétés présentant une conservation importante de leur séquence et de leur structure. Pour distinguer des signaux Wnt qui se recoupent, les cellules utilisent le contrôle spatial et temporel de l’expression des ligands et des récepteurs, la diversité des récepteurs et co-récepteurs disponibles, ainsi que leur coopération à la surface cellulaire. Un exemple spécialisé est la signalisation Wnt7a/b dans le système nerveux central. Wnt7a et Wnt7b activent la signalisation β-caténine dans les cellules endothéliales du SNC, favorisent l’angiogenèse du SNC et soutiennent l’acquisition des propriétés de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En plus des récepteurs Frizzled et des co-récepteurs LRP5/6, cette voie nécessite Gpr124, un récepteur couplé aux protéines G d’adhésion, et Reck, une protéine ancrée au GPI. Dans cette étude, nous avons demandé si d’autres co-récepteurs Wnt connus pouvaient également contribuer à la signalisation Wnt7a/b dépendante de Gpr124/Reck.
Nous avons identifié RYK, un co-récepteur Wnt atypique, et MIB1, une ligase E3 ubiquitine, comme régulateurs de cette voie. Des essais rapporteurs en cellules et des analyses d’interaction génétique chez le poisson-zèbre ont montré que RYK contribue à la signalisation Wnt/β-caténine dépendante de Gpr124/Reck. L’analyse de l’interaction entre RYK et Gpr124 a révélé une association directe entre RYK et la région extracellulaire de Gpr124 contenant les sous-domaines LRR, Ig-like et HRM, avec une affinité de 58 μM mesurée par microscopie à force atomique. Cette interaction n’était pas modifiée par l’expression de Frizzled.
Afin d’explorer comment l’interaction RYK-Gpr124 pourrait influencer la signalisation, une analyse par spectrométrie de masse après biotinylation de proximité a été utilisée pour identifier les protéines associées à la région intracellulaire de Gpr124. Cette approche a identifié MIB1, précédemment impliquée dans l’internalisation de RYK et la régulation positive de la signalisation Wnt/β-caténine, comme protéine candidate associée à Gpr124. Des expériences cellulaires ont confirmé que MIB1 s’associe à Gpr124 à la membrane plasmique de manière dépendante du domaine intracellulaire de Gpr124, indépendamment de l’interaction extracellulaire Gpr124-RYK. La cartographie de cette interaction a montré qu’elle dépend d’un motif conservé du domaine intracellulaire de Gpr124, correspondant aux acides aminés 82-88. Cependant, les essais rapporteurs ont montré que cette interaction directe n’est pas essentielle à l’activité de signalisation Wnt/β-caténine de Gpr124. En revanche, la diminution ou l’inactivation de MIB1 réduit la signalisation Wnt7a/b dépendante de Gpr124/Reck, indiquant que MIB1 contribue à cette voie par un mécanisme qui reste à identifier.
Dans l’ensemble, ce travail soutient un modèle dans lequel RYK agirait comme un composant supplémentaire du complexe ligand-récepteur Wnt7a/b-Gpr124/Reck-Fzd/LRP5/6 par son interaction avec Gpr124. RYK pourrait affiner l’activité du complexe en fonctionnant comme co-récepteur accessoire capable d’engager les ligands Wnt via son domaine WIF tout en interagissant avec Gpr124. Par son activité d’ubiquitination, MIB1 pourrait influencer l’internalisation, le recyclage ou la dégradation des signalosomes activés par Wnt, dont sa cible connue, RYK. Ainsi, cette étude élargit la compréhension de l’organisation du complexe récepteur spécifique de Wnt7a/b et ouvre la voie à l’étude de la coordination entre co-récepteurs au cours de l’angiogenèse du SNC et de la formation de la BHE.